Protoplas isolasi, budaya dan fusi
genom untuk menghasilkan hibrida somatik, hibrida asimetris atau cybrids
ProductionCombining rekombinan organel
Transfer pria sterilitas sitoplasma
Micrografting
Mengatasi korupsi ketidakcocokan
Mass rapid propagasi scions elit dengan
mencangkok batang bawah yang
memiliki ke sifat yang diinginkan
seperti resistensi terhadap tanah-patogen dan penyakit
Untuk memungkinkan kelangsungan hidup
sulit untuk tunas akar
Pengembangan tanaman bebas virus
transformasi genetik
Eksplan yang berbeda dapat digunakan, tergantung pada
spesies tanaman dan metode istimewa kepada regenerasi serta metode transformasi
Pengenalan DNA asing untuk menghasilkan baru (dan biasanya diinginkan)
kombinasi genetik
Digunakan untuk mempelajari fungsi
gen
Kondisi apa sel-sel tumbuhan perlu mengalikan in vitro?
Kultur jaringan memiliki beberapa persyaratan penting:
Sesuai jaringan (kultur jaringan beberapa yang
lebih baik daripada yang lain)
Sebuah media yang cocok pertumbuhan yang mengandung sumber energi dan garam-garam
anorganik untuk memasok kebutuhan pertumbuhan sel. Hal ini dapat cair atau semipadat
Aseptik (steril) kondisi, seperti
mikroorganisme tumbuh jauh lebih cepat daripada jaringan tanaman dan hewan dan dapat dikuasai budaya.
Pertumbuhan regulator - pada tanaman, baik
auksin sitokinin &.
Sering subkultur untuk
menjamin nutrisi yang memadai dan
untuk menghindari membangun-up
dari metabolit limbah
polyphenolic
Banyak tanaman yang
kaya polyphenolic
Setelah cedera jaringan selama diseksi, senyawa tersebut
akan teroksidasi oleh polifenol
oksidase → jaringan berubah menjadi cokelat / hitam
Produk fenolik menghambat
aktivitas enzim dan dapat membunuh eksplan
Metode untuk mengatasi kecoklatan:
menambahkan antioksidan [asam askorbat, asam
sitrat, PVP (polivinilpirolidon),
dithiothreitol], arang aktif atau presoaking eksplan
dalam antioksidan
mengerami periode awal kultur dalam cahaya berkurang
/ gelap
sering transfer ke media segar
Sebuah media
nutrisi didefinisikan oleh
komposisi garam mineral, sumber karbon, vitamin, pengatur pertumbuhan tanaman dan suplemen
organik lainnya.
pH menentukan banyak
aspek penting dari struktur dan
aktivitas makromolekul biologis.
PH optimum 5,0-6,0
cenderung turun selama autoklaf dan pertumbuhan.
Tunas sel meristem mempertahankan kapasitas embrio untuk pembelahan
terbatas.
Isolated eksplan meristem kecil membutuhkan media kultur yang lebih kompleks
untuk bertahan hidup.
Meristem dan kultur meristem tip adalah metode untuk pemberantasan penyakit.
Budaya Tembak menyediakan sarana untuk berkembang biak chimeras periclinal.
Sitokinin mengganggu dominasi apikal dan meningkatkan produksi menembak aksila.
Peningkatan konsentrasi auksin meningkatkan perakaran Persentase dan jumlah
akar, tetapi menurunkan pemanjangan akar.
Efek akumulasi negatif dari auksin digunakan untuk Tahap III perakaran dapat
mempengaruhi kelangsungan hidup dan pertumbuhan in vitro mantan plantlet.
Tidak ada sambungan ke sistem vaskular dari
batang
Sebuah meristem apikal
dicotyledonous menembak khas terdiri dari kubah
berlapis aktif membagi
sel yang terletak di ujung ekstrim menembak,
dan ukuran sekitar 0,1 sampai 0,2 mm dengan diameter dan
0,2 sampai 0,3 mm panjang.
Meristem apikal tidak
memiliki koneksi ke sistem pembuluh darah batang. Di bawah meristem
apikal, daerah lokal pembelahan
sel dan pemanjangan merupakan
situs baru berkembang primordia daun.
Tunas lateral, masing-masing berisi
meristem apikal, mengembangkan dalam
axils daun subtending.
Dalam tanaman utuh, perkembangan dari tunas lateral biasanya dihambat oleh dominasi
apikal tunas ujung
terminal.
Pertumbuhan tunas terorganisir dari meristem
apikal tanaman berpotensi terbatas dan dikatakan tak
tentu.
Namun, meristem apikal
menembak dapat menjadi berkomitmen untuk pembentukan organ determinate seperti
bunga
Kultur in vitro pada meristem SHOOT
Beberapa temuan penting difasilitasi aplikasi dalam teknik kultur in vitro
untuk skala besar perbanyakan klonal dari meristem.
Penemuan bahwa virus-diberantas tanaman dapat dihasilkan dari kultur meristem
mengarah ke aplikasi luas prosedur untuk pemberantasan patogen jamur dan
bakteri rutin serta
Penemuan terakhir adalah penjelasan tentang peran sitokinin dalam penghambatan
dominasi apikal.
Temuan ini akhirnya diterapkan untuk meningkatkan produksi menembak aksila in
vitro
Penerapan metode ini dipercepat oleh perkembangan media kultur baik yang
mendukung propagasi dari keanekaragaman jenis tumbuhan
budidaya TAHAP
TAHAP 0: DONOR PLANT SELEKSI DAN PERSIAPAN
Eksplan kualitas dan respon berikutnya secara in vitro secara signifikan
dipengaruhi oleh kondisi fitosanitasi dan fisiologis dari tanaman donor
Sebelum pembentukan budaya, perhatian diberikan kepada pemilihan dan
pemeliharaan tanaman saham digunakan sebagai sumber eksplan.
Tanaman saham dipertahankan dalam bersih, kondisi yang terkendali yang
memungkinkan pertumbuhan aktif namun mengurangi kemungkinan penyakit.
Pemeliharaan spesifik patogen-tanaman saham diuji di bawah kondisi kelembaban
relatif lebih rendah, serta penggunaan irigasi tetes dan semprotan antibiotik,
telah terbukti efektif dalam mengurangi potensi kontaminasi eksplan calon.
Meningkatkan respon eksplan
Sejumlah praktek juga digunakan untuk meningkatkan respon eksplan dengan
memodifikasi status fisiologis tanaman saham. Ini meliputi:
Pemangkasan untuk merangsang pertumbuhan tunas lateral yang
Pretreatment semprotan yang mengandung sitokinin atau asam giberelat
Penggunaan solusi memaksa mengandung sukrosa 2% dan 200 mg / l
8-hydroxyquinoline sitrat untuk induksi tunas istirahat dan pengiriman zat
pengatur tumbuh untuk target jaringan eksplan
TAHAP I: PEMBENTUKAN BUDAYA secara aseptis
Adanya mikroba kontaminan dapat mempengaruhi kelangsungan hidup menembak,
pertumbuhan, dan tingkat multiplikasi. Bakteri dan jamur kontaminan sering
bertahan dalam jaringan budidaya yang muncul visual bebas kontaminan.
Akibatnya, adalah penting bahwa Tahap I budaya diindeks (disaring) untuk
kehadiran kontaminan mikroba internal yang sebelum untuk melayani sebagai
sumber eksplan ujung menembak dan nodal untuk perkalian Tahap II
Faktor-faktor berikut dapat mempengaruhi Tahap berhasil saya pembentukan
eksplan meristem: waktu explantation, posisi eksplan pada batang, ukuran
eksplan, dan oksidasi polifenol. Waktu explantation secara signifikan dapat
mempengaruhi respon eksplan in vitro.
Pada tanaman keras berkayu gugur, menembak kiat eksplan dikumpulkan pada
berbagai waktu selama musim semi siram pertumbuhan dapat bervariasi dalam
kemampuan mereka untuk proliferasi menembak
Inherent faktor
Eksplan juga menunjukkan kapasitas yang berbeda untuk pembentukan in vitro
tergantung pada lokasi mereka pada tanaman donor. Sebagai contoh, kelangsungan
hidup dan pertumbuhan eksplan tunas terminal biasanya lebih besar dari eksplan
tunas lateral yang
Eksisi (pemotongan) dari eksplan primer sering mempromosikan pelepasan
polifenol dan aktivitas oksidase stimulatespolyphenol dalam jaringan yang
rusak.
Pengetahuan tentang situs tertentu biosintesis hormon dalam tanaman utuh
memberikan wawasan ke dalam hubungan antara ukuran eksplan dan ketergantungan
pada pengatur tumbuh eksogen dalam medium. Sitokinin endogen dan auksin
disintesis terutama di ujung akar dan primordia daun, masing-masing.
Akibatnya, eksplan yang lebih kecil, terutama berbudaya kubah meristem apikal,
menunjukkan ketergantungan lebih besar pada suplementasi menengah dengan
sitokinin eksogen dan auksin untuk kelangsungan hidup menembak maksimum dan
pengembangan
TAHAP II:
proliferasi tunas aksila
Stadium II propagasi ditandai oleh pembentukan tunas ditingkatkan berulang
aksilaris dari tips menembak atau tunas lateral dikultur pada medium dilengkapi
dengan tingkat sitokinin yang relatif lebih tinggi untuk mengganggu
dominasi apikal tunas
ujung
TAHAP III: PRETRANSPLANT (rooting)
Pemanjangan tunas sebelum perakaran
Perakaran tunas individu atau rumpun menembak
Memenuhi persyaratan dormansi organ penyimpanan dengan pengobatan dingin
Prehardening budaya untuk meningkatkan kelangsungan hidup
Perkiraan biaya untuk rentang Tahap III dari 35% sampai 75% dari total biaya
produksi. Ini mencerminkan masukan yang signifikan dari tenaga kerja dan
perlengkapan yang dibutuhkan untuk menyelesaikan Tahap III perakaran.
TAHAP IV: TRANSFER KE LINGKUNGAN ALAM
Hal ini melibatkan acclimatizing atau pengerasan dari plantlet dengan kondisi
kelembaban relatif jauh lebih rendah dan intensitas cahaya yang lebih tinggi.
Bahkan ketika prosedur aklimatisasi secara hati-hati diikuti, tingkat
kelangsungan hidup miskin sering ditemui.
Tanaman Micropropagated sulit untuk transplantasi karena dua alasan utama:
modus heterotrofik gizi, dan kontrol miskin kehilangan air.
Tanaman berbudaya in vitro di hadapan sukrosa dan di bawah kondisi cahaya
terbatas dan pertukaran gas tidak menunjukkan atau sangat mengurangi kapasitas
untuk fotosintesis.
Mengurangi aktivitas fotosintetik dikaitkan dengan aktivitas RubPcase rendah.
Selama aklimatisasi, ada kebutuhan bagi tanaman untuk membuat transisi cepat
dari heterotrofik ke keadaan photoautotrophic untuk bertahan hidup.
Propagasi
dari Jaringan Nonmeristematic:
Embriogenesis Nonzygotic
• embriogenesis Nonzygotic terjadi di antara sel yang
berbeda secara luas dan jenis jaringan
dan dapat dianggap sebagai kemampuan
universal tumbuhan tingkat tinggi.
• embrio Nonzygotic
tampaknya berasal dari sel tunggal, bukan sebagai hasil
dari reproduksi seksual, tetapi
sebaliknya identik dengan
rekan-rekan zigotik mereka.
• embriogenesis Nonzygotic
meyakinkan menunjukkan totipotency seluler dan merupakan metode yang sangat efisien perbanyakan tanaman.
• kultur sel embriogenik
yang banyak digunakan untuk manipulasi
genetik seperti seleksi in vitro dan teknologi transgenik.
Embrio dapat didefinisikan sebagai tahap awal multiseluler dikenali
dari seorang individu yang terjadi
sebelum mereka telah mengembangkan struktur atau organ karakteristik
suatu spesies.
Pada sebagian besar organisme, embrio adalah entitas morfologis
berbeda yang berfungsi sebagai tahap peralihan dalam transisi antara gametophytic untuk
siklus hidup sporophytic.
Zigotik embrio zigotik dan
bukan
Pada tumbuhan tingkat tinggi, kita paling akrab
dengan embrio yang berkembang di dalam
benih; embrio seperti
biasanya muncul dari fusi gamet produk (zigot)
berikut reproduksi seksual dan disebut embrio
zigotik, meskipun benih ditanggung embrio juga
dapat mengembangkan apomictically (yaitu, tanpa reproduksi
seksual ).Namun, tanaman yang unik dalam morfologi
dan fungsional nonzygotic embrio yang benar juga
bisa muncul dari sel yang berbeda secara luas dan jenis jaringan di sejumlah titik yang berbeda dari kedua fase gametophytic dan
sporophytic dari siklus hidup.
Embriogenik sistem kultur
"Somatik embrio" tumbuh dari sel-sel somatik; "embrio
haploid atau serbuk sari" yang berasal dari serbuk
sari atau sel ibu mikrospora; "embrio nucellar" terbentuk dari jaringan benih nonzygotic
nucellar; "embrio sekunder langsung" berkembang dari embrio yang
terbentuk sebelumnya, dan sebagainya pada ....Sebagian besar jenis embrio berbagi ciri
umum untuk dapat dimanipulasi
melalui kultur in vitro. Seperti
sistem budaya embriogenik membentuk dasar untuk pendekatan bioteknologi banyak perbaikan
tanaman karena mereka memungkinkan
tidak hanya perbanyakan tanaman klonal,
tetapi juga perubahan spesifik dan
diarahkan yang dapat diperkenalkan ke dalam diinginkan, individu elit dengan
rekayasa genetik dari sel somatik. Sel-sel individual dimodifikasi dan embrio kemudian dapat efisien
dikalikan in vitro untuk nomor yang sangat tinggi
sebelum pengembangan tanaman. Pendekatan
ini untuk perbaikan genetik bypasses
konsekuensi yang tidak diinginkan
reproduksi seksual (rekombinasi genetik massa
dan siklus diperlukan seleksi) yang melekat dalam
teknologi pemuliaan konvensional.
SIFAT UMUM DARI PROTOKOL KULTUR embriogenik
Mengingat berbagai eksplan yang berbeda, budaya kondisi dan media yang
digunakan untuk memulai dan mempertahankan budaya embriogenik, generalisasi
tertentu dapat dibuat mengenai metodologi dasar.
Penggunaan zat pengatur tumbuh tanaman tertentu (PGRS), yang diperlukan dalam
kebanyakan kasus, akan dibahas kemudian sehubungan dengan inisiasi sel
embriogenik.
Persyaratan lingkungan untuk pertumbuhan optimal kultur sering sangat spesifik,
tapi tidak biasa. Budaya mungkin memerlukan pertumbuhan baik dalam gelap atau
cahaya atau kombinasi keduanya dari waktu ke waktu, optimalisasi yang dapat diukur
secara eksperimental.
Budaya dalam kegelapan mungkin diperlukan untuk mencegah efek cahaya pada
memicu proses biologis yang banyak tanaman dapat mempengaruhi pertumbuhan
populasi sel embriogenik.
Persyaratan temperatur juga spesifik, tetapi cenderung berada dalam kisaran
"suhu kamar" (yaitu, 23-27 ° C). Meskipun kesamaan dalam persyaratan
budaya, perbaikan dalam pengembangan dan pematangan embrio nonzygotic semakin
sering diperoleh dengan optimasi komposisi media
Zigotik dan Non zigotik
Perbandingan embrio zigotik yang khas terjadi di dalam biji (A) dengan
embriogenesis nonzygotic terjadi proliferasi in vitro (B). Embriogenesis
zigotik ditandai sebagai sangat diatur, seperti bahwa embrio melewati tahap
serentak perkembangan yang berbeda, sedangkan embriogenesis nonzygotic sering
tidak seragam, dengan tahapan yang hadir pada waktu tertentu. Embrio Nonzygotic
dapat melewati pematangan dan menjadi tidak teratur, menambah massa jaringan
proembryonic.
embrio perkembangan
Embrio zigotik dan nonzygotic
berbagi pola kotor
sama pembangunan, dengan kedua biasanya melewati
tahap globular, scutellar,
dan coleoptilar untuk monokotil, atau bulat, jantung,
torpedo, dan tahap cotyledonary untuk dicots
dan tumbuhan runjung. Umumnya, anatomi dan
morfologi embrio yang berkembang
baik nonzygotic setia dengan jenis embrio zigotik
yang sesuai, sehingga mereka dapat
dengan mudah diidentifikasi oleh mata
atau dengan bantuan mikroskop
stereo yang.
pematangan
Pematangan adalah peristiwa terminal embriogenesis dan
ditandai oleh pencapaian morfologi
embrio dewasa; akumulasi
karbohidrat penyimpanan, lipid, dan protein (lihat
bagian di atas pada in vivo dibandingkan dalam kondisi pertumbuhan in vitro), pengurangan kandungan air, dan, sering , sebuah penurunan bertahap atau penghentian metabolisme. Nonzygotic embrio biasanya tidak matang
benar jika dibandingkan dengan embrio
zigotik. Bahkan, dalam
kasus dominan, pertumbuhan
yang cepat terus terjadi, menyebabkan
perkecambahan prekoks.
TEKNOLOGI BENIH SINTETIS
Sebuah benih sintetik didefinisikan
sebagai embrio somatik yang direkayasa untuk digunakan praktis dalam produksi tanaman komersial (Gray dan Purohit, 1991). Aplikasi untuk
benih sintetik bervariasi tergantung pada kecanggihan relatif sistem produksi yang ada untuk tanaman tertentu
dan kesempatan untuk perbaikan.
Tunas sel meristem mempertahankan kapasitas embrio untuk pembelahan
terbatas.
Isolated eksplan meristem kecil membutuhkan media kultur yang lebih kompleks
untuk bertahan hidup.
Meristem dan kultur meristem tip adalah metode untuk pemberantasan penyakit.
kultur Tunas menyediakan sarana untuk berkembang biak chimeras periclinal.
Sitokinin mengganggu dominasi apikal dan meningkatkan produksi menembak aksila.
Peningkatan konsentrasi auksin meningkatkan perakaran Persentase dan jumlah
akar, tetapi menurunkan pemanjangan akar.
Efek akumulasi negatif dari auksin digunakan untuk Tahap III perakaran dapat
mempengaruhi kelangsungan hidup dan pertumbuhan in vitro mantan plantlet.
Tidak ada sambungan ke sistem vaskular dari batang
Sebuah meristem apikal dicotyledonous menembak khas terdiri dari kubah berlapis
aktif membagi sel yang terletak di ujung ekstrim menembak, dan ukuran sekitar
0,1 sampai 0,2 mm dengan diameter dan 0,2 sampai 0,3 mm panjang.
Meristem apikal tidak memiliki koneksi ke sistem pembuluh darah batang. Di
bawah meristem apikal, daerah lokal pembelahan sel dan pemanjangan merupakan
situs baru berkembang primordia daun.
Tunas lateral, masing-masing berisi meristem apikal, mengembangkan dalam axils
daun subtending. Dalam tanaman utuh, perkembangan dari tunas lateral biasanya
dihambat oleh dominasi apikal tunas ujung terminal.
Pertumbuhan tunas terorganisir dari meristem apikal tanaman berpotensi terbatas
dan dikatakan tak tentu.
Namun, meristem apikal menembak dapat menjadi berkomitmen untuk pembentukan
organ determinate seperti bunga.
Myo-inositol
Myo-inositol atau
meso-inositol adalah konstituen
alami dari tanaman dan sebagai fosfatidil inositol-bisa menjadi faktor penting dalam fungsi membran
Pada tumbuhan inositol sebagai inositol fosfat dapat bertindak sebagai utusan kedua tindakan
utama auksin. Mungkin
memiliki peran sebagai pembawa dan penyimpanan IAA
sebagai IAA-myo-inositol ester.
Dalam budaya jaringan tanaman myo-inositol bisa
menjadi prekursor penting dalam
biosintesis jalur yang mengarah ke pembentukan pektin dan hemiselulosa yang dibutuhkan dalam sintesis dinding sel (Loewus et
al, 1962;. Verma dan Dougall, 1979) dan mungkin memiliki peran dalam penyerapan dan pemanfaatan ion (Kayu
dan Braun, 1961).
Haploids dapat
dihasilkan dari gametophytes
laki-laki (androgenesis) atau gametophytes
perempuan (gynogenesis).
Gynogenesis dapat dirangsang dalam ovula dibuahi
atau budaya ovarium.
Keberhasilan kultur haploid tergantung pada
genotipe, media, dan kondisi
budaya.
Tahap perkembangan mikrospora pada saat budaya adalah penting untuk keberhasilan androgenesis.
Kromosom haploids dua kali lipat (diploid) yang berguna dalam pemuliaan proyek.
Kemampuan
untuk menghasilkan
tanaman haploid adalah aset yang luar biasa dalam studi pemuliaan
genetik dan tanaman.
Studi heritabilitas disederhanakan karena, dengan
hanya satu set kromosom, mutasi resesif yang
mudah diidentifikasi.
Selain itu, dua kali lipat jumlah
kromosom dari haploid
untuk menghasilkan hasil haploid dua kali lipat di
sebuah pabrik sepenuhnya homozigot.
Secara teoritis, genotipe hadir antara sekelompok besar haploids dua kali lipat yang berasal dari sebuah hibrida F1 mewakili dalam bentuk tetap genotipe
yang diharapkan dari populasi F2.
Penggunaan haploids dua kali lipat dalam program pemuliaan sehingga dapat sangat mengurangi waktu yang dibutuhkan untuk pengembangan
kultivar ditingkatkan.
Untuk menjadi paling berguna, sejumlah besar haploids dari berbagai genotipe
yang diperlukan.
androgenesis
PENGEMBANGAN HAPLOIDS
Tanaman haploid berkembang dari kultur antera baik secara langsung atau tidak
langsung melalui fase kalus.
Androgenesis langsung, bagaimanapun, bukanlah sebuah suspensor atau endosperma
hadir.
Pada tahap globular pembangunan, sebagian besar embrio dilepaskan dari dinding
sel serbuk sari (exine).
Mereka terus berkembang, dan setelah 4 sampai 8 minggu, kotiledon terungkap dan
plantlet muncul dari anter
Media yang padat atau cair
Media kultur antera sering dipadatkan dengan menggunakan agar-agar. Karena agar
mungkin mengandung senyawa penghambat untuk proses androgenik dalam beberapa
spesies, penggunaan agen pembentuk gel alternatif telah diselidiki.
Ficoll, Gelrite ™, agarosa, dan pati telah terbukti unggul untuk agar untuk
memperkuat media yang anter budaya di berbagai spesies
Penggunaan medium cair telah dianjurkan oleh beberapa peneliti sebagai cara
untuk menghindari zat-zat yang berpotensi penghambatan di agen pembentuk gel.
Anter dapat ditempatkan pada permukaan medium, membentuk apa yang disebut
alternatif, mikrospora dapat diisolasi dan dikultur secara langsung dalam media
cair "budaya mengambang."
Metode transformasi
ž Metode senjata gen atau penembakan mikro-proyektil.
ž Metode ini sering digunakan pada spesies jagung
dan padi.
ž Untuk melakukannya, digunakan senjata yang dapat
menembakkan mikro-proyektil berkecepatan tinggi ke dalam sel tanaman.
ž Mikro-proyektil tersebut akan mengantarkan DNA
untuk masuk ke dalam sel tanaman
ž Metode transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium
tumefaciens.
ž Bakteri Agrobacterium tumefaciens dapat
menginfeksi tanaman secara alami karena memiliki plasmid Ti, suatu vektor
(pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing.
ž Di dalam plasmid Ti terdapat gen yang
menyandikan sifat virulensi untuk menyebabkan penyakit tanaman tertentu.
ž Gen asing yang ingin dimasukkan ke dalam tanaman
dapat disisipkan di dalam plasmid Ti.
ž Selanjutnya, A. tumefaciens secara
langsung dapat memindahkan gen pada plasmid tersebut ke dalam genom (DNA)
tanaman.
ž Setelah DNA asing menyatu dengan DNA tanaman
maka sifat-sifat yang diinginkan dapat diekspresikan tumbuhan
ž Metode elektroporasi.
ž Pada metode elektroporasi ini, sel tanaman yang
akan menerima gen asing harus mengalami pelepasan dinding sel hingga menjadi
protoplas (sel yang kehilangan dinding sel).
ž Selanjutnya sel diberi kejutan listrik dengan
voltase tinggi untuk membuka pori-pori membran sel tanaman sehingga DNA asing
dapat masuk ke dalam sel dan bersatu (terintegrasi) dengan DNA kromosom
tanaman.
ž Kemudian, dilakukan proses pengembalian dinding
sel tanaman.
Langkah Dasar
Rekayasa Genetika
Pemotongan DNA:
Enzim restriksi: enzim
bakteri yang mengenali dan mengikat untuk sekuens pendek DNA yang
spesifik, dan kemudian lucu
DNA antara nukleotida tertentu dalam urutan.
Vektor: agen digunakan untuk membawa
gen yang diinginkan - biasanya plasmid
Plasmid: molekul DNA
sirkular yang meniru.
Membuat DNA
rekombinan
DNA fragmen bunga
(yang telah dipotong) digabungkan
dengan vektor.
DNA ligase -
ikatan enzim 2
ujung fragmen ke
vektor.
kloning
Kloning gen: proses
pembuatan banyak salinan gen
Bakteri berkembang biak dengan pembelahan biner.
penyaringan
Sel-sel yang telah menerima gen dari bunga dipisahkan.
Sel-sel kemudian terus menghasilkan protein dikodekan oleh gen
Pemotongan DNA
& Membuat DNA
rekombinan
Bagaimana Enzim restriksi bekerja:
Para Enzim mengenali
urutan tertentu pada Plasmid
Manusia dan Bakteri
Para Enzim memotong
untai.
Memotong menghasilkan fragmen DNA dengan helai
pendek pada setiap akhir yang melengkapi satu sama lain
"Sticky Berakhir"
Kedua DNA manusia
dan Plasmid "Open
Up" dengan ujung lengket yang sama yang
tersisa
Mereka Bind Bersama
Konfirmasi dari
Kloning Gen
Salah satu metode yang digunakan mengidentifikasi gen tertentu disebut Blot Selatan
langkah-langkah:
Potong DNA dari bakteri
dengan enzim restriksi.
Fragmen DNA dipisahkan
oleh gel direndam dalam larutan kimia.
Gel elektroforesis - menggunakan medan
listrik dalam gel untuk molekul terpisah
oleh ukuran mereka.
DNA bermuatan
negatif dimasukkan ke dalam
sumur.
Mereka tertarik ke
kutub positif dari medan listrik.
Fragmen DNA Terkecil
bergerak tercepat.
DNA yang dipisahkan kemudian ditransfer ke kertas filter (dihapus) dan
solusi probe ditambahkan.
Probe: radioaktif RNA atau potongan DNA untai tunggal yang saling melengkapi
gen yang diinginkan
Hanya fragmen DNA komplementer untuk probe akan membentuk dan mengikat pita.
Mengapa ini?
Koloni bakteri dapat digunakan untuk
menghasilkan jumlah besar protein
(digunakan untuk belajar atau membuat obat)
Rekayasa genetika Obat dan Vaksin
Saat ini, perusahaan farmasi di seluruh dunia memproduksi protein penting
menggunakan rekayasa genetika.
Vaksin: larutan yang mengandung semua atau bagian dari versi patogen berbahaya;
digunakan untuk mencegah penyakit virus (tidak merespon obat)
Banyak vaksin yang dibuat dengan menggunakan rekayasa genetika
DNA sidik
jari
DNA sidik jari: suatu
pola pita gelap pada film
fotografi yang dibuat ketika
sebuah fragmen DNA individu
pembatasan dipisahkan dengan elektroforesis gel, diperiksa, dan
terkena film sinar-X.
Sidik jari DNA dapat digunakan untuk menetapkan ayah, mengidentifikasi kelainan genetik, atau dalam forensik (studi
ilmiah tentang penyebab cedera atau kematian dalam kegiatan kriminal)
meningkatkan Tanaman
Insinyur genetik dapat
menambahkan karakteristik menguntungkan
bagi tanaman
Tahan terhadap serangga (pestisida tidak lagi perlu);
resisten terhadap pembunuh gulma (tanaman sehingga
tidak akan mati, tapi gulma akan); perbaikan nutrisi - padi + jagung
Agrobacterium
Menginfeksi di mahkota akar atau hanya di bawah garis tanah.
Dapat bertahan hidup independen dari tanaman inang dalam tanah.
Menginfeksi tanaman melalui istirahat atau luka.
Umum penyakit semak berkayu, tanaman herba, dicots.
Galls (tumor Mahkota empedu) adalah kutil-seperti bola struktur mirip dengan
tumor.
Langkah Agrobacterium-tanaman
interaksi sel
Sel-sel pengakuan
Transduksi sinyal dan aktivasi transkripsi gen virtual_
Suami-istri metabolisme DNA
transportasi antar
nuklir impor
T-DNA integrasi
T-DNA
DNA transfer (disingkat T-DNA) adalah DNA
ditransfer dari menginduksi
tumor-(Ti) plasmid
dari beberapa spesies bakteri Agrobacterium tumefaciens seperti Agrobacterium rhizogenes
dan.
T-DNA membawa gen
yang terlibat dalam sintesis hormon
pertumbuhan tanaman (auksin, sintesis auksin; CYT,
sitokinin sintesis) dan produksi asam amino
dengan berat molekul rendah dan
derivatif gula fosfat disebut opines (OCS,
octopine; mas, mannopine,
dan ags , agropine).
Agrobacteria biasanya diklasifikasikan berdasarkan jenis opines ditentukan oleh bakteri
T-DNA.
ž Plasmid Ti adalah vektor alamiah yang digunakan untuk
mentransfer DNA ke dalam sel tanaman.
ž Bakteri yang membawa plasmid Ti (contohnya:
Agrobacterium tumefaciens) dapat menyebabkan tumor pada tanaman yang disebut crown
gall, terutama tanaman dikotil.
ž Pada sebagian besar plasmid Ti, terdapat lima
kompleks gen, yaitu T-DNA (bagian yang ditransfer dan menyatu dengan genom
tanaman sehingga), gen virulen (vir) yang terdiri dari 50 kilo-basa
untuk mengatur proses transfer T-DNA ke dalam DNA tanaman, gen tra/trb
yang mengatur perpindahan plasmid Ti antarbakteri, bagian yang mengatur sistem
replikasi plasmid, dan bagian gen yang menyandikan molekul opin.
ž Molekul opin ini akan dihasilkan oleh jaringan
tanaman yang terinfeksi bakteri pembawa plasmid Ti
Agrobacterium-diinduksi tumor tanaman mengandung konsentrasi tinggi dari:
Tanaman hormon (auksin, sitokinin)
Opines (octopine, nopaline)
Agrobacterium-host pengakuan
sel adalah proses dua langkah
Langkah 1.Loosely terikat: polisakarida asetat
disintesis.
Langkah mengikat 2.Strong:
bakteri terikat mensintesis
filamen selulosa untuk
menstabilkan pengikatan awal,
sehingga hubungan erat antara Agrobacterium dan sel inang.
